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RNA-seq揭示靈芝多糖對腸樣Caco-2/DCs共培養模型中樹突狀細胞DCs的間接刺激作用

2020-03-27

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發表期刊:Journal of Functional Foods

影響因子:3.197


文章題目:Indirectly stimulation of DCs by Ganoderma atrum polysaccharide in intestinal-like Caco-2/DCs co-culture model based on RNA-seq

技術手段:RNA-seq、qPCR、Elisa、western blot

派森諾生物與南昌大學攜手合作,于2020年2月在《Journal of Functional Foods》上發表了靈芝多糖對腸樣Caco-2/DCs共培養模型樹突狀細胞的間接刺激作用的研究成果。


研究背景


靈芝多糖(PSG-1)是一種高純度的蛋白結合多糖,含有10.1%的蛋白質和17種氨基酸,大量的研究表明PSG-1對多種免疫細胞的免疫調節活性有影響,直接接觸T淋巴細胞并刺激表面受體。然而,PSG-1作為一種大分子多糖,到達腸道后首先與腸上皮細胞(IECs)接觸,并不能直接刺激免疫細胞。樹突狀細胞(DC)作為最有效的抗原呈遞細胞,具有強大的刺激初始免疫反應的能力,成熟的DCs可以表達多種共刺激分子,同時合成和分泌腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細胞介素(IL)-1等多種細胞因子,誘導和調節免疫應答。近年來,許多研究表明,從食品和中藥中分離的天然多糖能夠誘導DCs成熟。為了更好地模擬腸道微環境,了解腸道上皮細胞與其內部免疫細胞之間的相互作用,該研究建立了Caco-2/DCs共培養模型。利用RNA-seq對PSG-1刺激的DCs共培養模型中的所有轉錄本進行整體篩選,在此基礎上進一步研究了PSG-1對DCs免疫功能的影響及其可能的分子機制。


研究方法


RNA-seq、qPCR、Elisa、western blot


研究結果


1、利用illumina平臺對PSG-1刺激的DCs的所有轉錄本進行整體篩選。生物信息學分析發現了PSG-1組與對照組共有2293個差異表達基因,其中上調基因1180個,下調基因1113個如火山圖所示。PCA主成分分析和表達量熱圖可以看出PSG-1對樣本表達量的影響是非常明顯的。

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圖1  mRNA表達譜和差異基因火山圖


2、根據獲得的DEGs,進行GO富集分析和KEGG富集分析。GO富集的結果表明,在生物過程的前10個顯著富集GO項中,與免疫相關的GO項所占比例較大,如“免疫系統過程”、“防御反應”和“免疫系統過程的正調控”,表明PSG-1在Caco-2/DCs共培養模型中仍對DCs的免疫功能產生影響。

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圖2 差異表達基因的GO富集分析


3、通過對DEGs進行KEGG信號途徑分析,共鑒定出109條顯著富集途徑。為了探討PSG-1在Caco-2/DCs共培養模型中是否能通過與Caco-2的直接接觸激活Caco-2與DCs之間的“對話”,最終影響樹突狀細胞的免疫功能。因此,與“環境信息處理”相關的顯著富集途徑中的3個途徑被進一步研究:“細胞因子-細胞因子-受體相互作用”、“NF-κB 信號通路”和“MAPK信號通路”。

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圖3 顯著性前20個的KEGG富集途徑氣泡圖

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圖4 NF-κB途徑的熱圖和KO圖

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圖5  MAPK途徑的熱圖和KO圖


4、隨機選取15個與MAPK途徑和NF-κB途徑相關的DEGs,驗證RNA-seq結果,比較RT-qPCR和RNA-seq分別檢測的基因表達情況,從圖6中可以看出PSG-1間接作用后DCs的mRNA表達上調或下調趨勢一致。

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圖6  qPCR驗證RNA-seq


5、采用ELISA法對DCs周圍培養液中典型細胞因子水平進行了定量分析,來驗證PSG-1在翻譯水平上對DCs分泌細胞因子的影響。如圖7所示,PSG-1可促進DCs細胞產生細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10、RANTES、MIP-1α和MCP-1,除MCP-1外,上述細胞因子均呈劑量依賴性增加。上述細胞因子在轉錄和翻譯水平上的升高說明PSG-1增加了腸樣Caco-2/DCs共培養模型DCs上炎癥介質和趨化因子的表達,進而影響其免疫功能。

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圖7  DCs共培養模型中用PSG-1刺激產生細胞因子和趨化因子的水平


6、采用western blot法檢測了間接暴露于PSG-1(40、80和160μg/mL)24小時后DCs中與NF-κB途徑和MAPK途徑相關的關鍵蛋白的表達。如圖8所示,PSG-1顯著促進腸內Caco-2/DCs共培養模型中p-IκBα和p-p65的水平,表明PSG-1對NF-κB信號通路的激活是其對腸樣Caco-2/DCs共培養模型DCs免疫促進作用的基礎。同樣,與對照組相比,ERK1/2、JNK和p38的磷酸化被激活,并且其作用呈劑量依賴性。說明PSG-1通過MAPK信號通路對DCs仍有穩定的免疫促進作用。

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圖8 PSG-1間接刺激DCs的NF-κB和MAPK途徑關鍵蛋白質的免疫印跡帶和相對強度


文章小結


綜上所述,該研究利用RNA-seq進行了DEGs、GO和KEGG分析,闡明PSG-1在腸樣Caco-2/DCs共培養模型中間接誘導DCs的免疫應答和免疫功能,其中NF-κB和MAPK信號通路起重要作用。揭示了PSG-1可促進DCs的成熟,調節DCs在腸道內的免疫反應,是誘導機體主動免疫、維持腸道穩態、最終提高機體免疫力的關鍵。


本研究的測序和數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。


原文索引:

Indirectly stimulation of DCs by Ganoderma atrum polysaccharide in intestinal-like Caco-2/DCs co-culture model based on RNA-seq.[J]. Journal of Functional Foods.2020,67.



文章鏈接:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1756464620300748?via%3Dihub





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